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タンパク質の精製(濃縮、バッファー交換、分画)

迅速かつ確実なタンパク質精製

ポールのメンブレンはタンパク質試料の迅速かつ確実な 濃縮、脱塩、バッファー交換、分画を可能にします。

タンパク質などの生体分子試料の精製におきまして、標的とするタンパク質を選択的に分離するためには複雑な一連の工程を必要とします。その精製の工程において、タンパク質試料を調製するために、濃縮または脱塩を行う場合があります。

 

メンブレンを用いた分離法は技術が確立しており、タンパク質の精製において極めて強い利点があります。ここに異なる分離技術を組み合わせることで、全体の工程を通して、処理の柔軟性や幅広い分離メカニズムのオプションを用いることができます。

 

 

精密ろ過は微粒子や細胞の破片の除去に適した方法です。

 

現在、目的のタンパク質を簡便かつ高純度に大量精製する手法として組み換えタンパク質の発現系は多用されています。ヒスチジン(His)タグを付けたタンパク質の分離精製法に使用される固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー(IMAC)のような、ビーズを用いた分離システムを扱う際には、タンパク質低吸着性のメンブレンを搭載したマルチウェルフィルタープレートによる吸引/ 遠心が理想的です。また、タンパク質精製前に菌破砕物や細胞断片を除去、微粒子を多く含むサンプルの清澄化といったアプリケーションに最適です。

 

 

限外ろ過は分子サイズの差により分子を分離します。

 

限外ろ過デバイスは生体分子試料の濃縮、バッファー交換、サイズ分画が必要な際に広く使用されています。限外ろ過は強力な有機溶媒を必要としない、フィルターメンブレンによる分離ですので、タンパク質にとって穏やかな条件で行える処理です。

 

ポールの限外ろ過用遠心ろ過デバイスは、核酸やタンパク質の一般的な処理過程を大幅に簡素化します。本デバイスはわずか数分で、50 μLから60 mLまでのサンプルから効率的に濃縮や脱塩を行います。

ポールの遠心ろ過デバイスは、膜素材に生体分子低吸着性のメンブレンを使用しており、通常90%以上の高い回収率を安定して得ることができます。

 

限外ろ過はメンブレンを用いて、液体中のごく微小な粒子や溶解分子を分離する技術です。分離の主な要因は分子のサイズによるものですが、分子の形状や電荷といった要素も関与します。メンブレンの孔径よりも大きな分子はメンブレンのポリマーマトリックス内部ではなく表面で保持されることで、限外ろ過の過程において濃縮されます。

 

メンブレンを使用しない処理(クロマトグラフィー、透析、溶媒による抽出、遠心)に比べて、限外ろ過には以下のような利点があります。

 

▶処理対象の分子に対してより穏やか

▶不安定なタンパク質を変性させる有機抽出が不要

▶イオン強度やpH を維持

▶高速、かつ比較的安価

▶低温(例えばコールドルーム内)でも操作可能

▶高効率、かつ分子の濃縮&精製の同時処理が可能

 

 

一般的に、限外ろ過には以下の3 つのアプリケーションがあります。

 

濃縮

限外ろ過は低濃度のタンパク質サンプルやDNA/RNAサンプルを濃縮するのに便利な方法です。分子に影響を与えず(100Kbほどの大きなDNAもせん断せず、タンパク質の酵素活性の低下を招かない)、かつ高効率(通常、回収率は90%以上)です。

 

脱塩とバッファー交換(ダイアフィルトレーション)

限外ろ過は脱塩や塩交換、界面活性剤の除去、標識済み分子からの非結合分子の除去、低分子物質の除去、イオン強度やpHの迅速な交換を行いたい場合に便利で効率的な方法です。

 

分画

限外ろ過では類似した分子量を持つ2つの分子を明確に分離することはできません。分子を効果的に分離するには、少なくとも分子サイズで1オーダー(10倍)の違いが必要です。限外ろ過を使用した分画は、タンパク質フリーなろ液の調製、DNAおよびタンパク質サンプルからの非結合/ 未反応標識の除去、PCR産物の精製といったアプリケーションにおいて効果的です。

分画したい2つの目的タンパクの分子サイズが類似している場合はクロマトグラフィーの項目をご参照ください。

 

以下のメンブレンは高い性能と安定性をもち、幅広いアプリケーションに適しています。

 

  • 用途:高速濃縮、脱塩
    • オメガ・ポリエーテルスルホン限外ろ過メンブレン

 

  • 用途:精密ろ過による微粒子の除去
    • バイオイナート・修飾ナイロンメンブレン
    • スーポア・ポリエーテルスルホンメンブレン
    • GHP 親水性ポリプロピレンメンブレン

 

限外ろ過メンブレンの保持特性は分画分子量(MWCO)で表されます。

 

MWCO の値は「その膜で90%以上保持できる低濃度の球状分子(通常はタンパク質)のおおよその分子量」と定義されています。

ただし、分子の形状がメンブレンの保持率に直接影響を与える場合もあります。

例えばDNA のような直鎖状の分子は、同じ分子量の球状分子が保持されるような孔径の膜を通過する場合があります。

 

適切なMWCO の選定

 

通常タンパク試料をろ過する場合、サンプル量が決まったら、それに適したMWCO( 限外ろ過の場合)、あるいは孔径(精密ろ過の場合)を選定します。

 

  • タンパク質を保持する場合

MWCO が保持する溶質の分子量の1/3 〜1/6 であるメンブレンを選定することを推奨します。

透過流速が重要である場合は、選定範囲内で最大のMWCO(1/3)のメンブレンを、また回収率が重要である場合には、より高密度なメンブレン(1/6)を選定することを推奨します。

 

  • タンパク質を透過させる場合

対象となるタンパク質分子量の3倍~6倍のMWCOを選ぶことを推奨します。

透過させる分子と膜上に保持したい分子が混在している試料では、保持率が重要な場合は透過させるタンパク質の3倍のMWCOを選び、迅速な処理を重要とする場合には6倍のMWCOを選ぶことを推奨します。

 

限外ろ過メンブレンの分子保持率を左右する要因には様々なものがあり、分子量はそういった要因の一つに過ぎないということを認識しておくことは重要です。このため、特定アプリケーションに適したMWCO を選定するには、分子の形状や電荷、サンプル濃度、他の溶質の存在、操作条件など多くの要因を考慮しなければなりません。

 

メーカーによりメンブレン製品のMWCO 定格付けに使用する分子が異なるため、特定アプリケーションにおけるメンブレン性能を検証するにはパイロット試験を行うことが重要です。

 

透過分子を増加させる一般的変数:

▶ 1mg/mL以下のサンプル濃度

▶球状分子より直鎖状分子

▶遠心分離機の遠心力で生じる高い膜間差圧(これは、DNA断片などの直鎖状分子の場合は特に重要です。この場合、遠心力を減少することにより、膜による分子保持率を高めることができます)

▶分子の良好な分散を促進するバッファー組成

▶分子の形状を変化させるpHやイオン強度(最適でない場合は、コンフォメーションの変化や凝集の原因となります)

 

透過分子を減少させる一般的変数:

▶ 1mg/mL以上のサンプル濃度

▶分子会合を助長するバッファー条件

▶サンプル濃度を増加させる他の分子の存在

▶より低い膜間差圧(遠心分離機の場合での低遠心力)

▶メンブレンやデバイスへの吸着

▶低温(24℃ に対する4℃)

 

 

ポールは、様々なサンプル量に適した限外ろ過用の遠心ろ過デバイスを提供しています。これらの遠心ろ過デバイスは、より速い流量およびより容易な取扱いを行えるよう設計し提供しております。

 

弊社の限外ろ過用遠心ろ過デバイス(使用サンプル容量)

 

  • アクロプレップ 384-ウェル フィルタープレート        (< 100 μ L)
  • アクロプレップ アドバンス 96-ウェル フィルタープレート (< 1 mL)
  • ナノセップ遠心ろ過デバイス               (< 0.5 mL)
  • マイクロセップ アドバンス遠心ろ過デバイス       (0.5 - 5 mL)
  • マクロセップ アドバンス遠心ろ過デバイス        (5 - 20 mL)
  • ジャンボセップ 遠心ろ過デバイス            (20 - 60 mL)
Nanosep® and Nanosep MF Centrifugal Devices

技術資料

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Nanosep and Microsep Concetration Selection Guides

The Nanosep and Microsep concentration selection guides are meant to serve as a recommendation for concentrating protein samples. The total volume of liquid in the device determines the final retentate volume. By adding buffer under the device insert, you can set your dead stop volume and thereby select the concentration factor.

Centrifugal Device Request

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