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クロマトグラフィー

タンパク質の精製

革新的なクロマトグラフィー精製プラットフォーム

現在、研究、製薬、タンパク質の精製のために様々な技術が用いられておりますが、その中でもクロマトグラフィーは、生体分子の精製に不可欠な技術の一つとして長い間利用されています。クロマトグラフィーでは、固相担体で構成されるクロマトグラフィーマトリックスに混合サンプルを通過させます。クロマトグラフィーマトリックスの特性は、担体の構造や化学的性質によって決まります。精製対象とするサンプルの性質により、どの種類の担体を選べばよいのかは異なります。

 

例えば、細胞培養物または血清などを含む複雑なサンプルからのタンパク質精製は、いくつかのクロマトグラフィー方法を用いて行います。第1の工程として、イオン交換またはミックスモードカラムを用いたクロマトグラフィーを行い、サンプルを分画し、標的分子を含むタンパク質の集団を得た後、続けて、目的とする精製純度レベルに達するまで、その集団をさらに分画するための工程として、アフィニティーまたはサイズ排除クロマトグラフィー(ゲルろ過もしくはゲル浸透ろ過)、または、イオン交換またはミックスモードカラムを使用したクロマトグラフィーを行い、最終的に、標的タンパク質を単離することができます。

 

ポールは様々な用途と処理容量のクロマトグラフィー担体およびメンブレン製品を提供しており、お客様のタンパク質精製を包括的にサポートします。

 

 

アフィニティークロマトグラフィーは、固相マトリックスに固定化されたリガンドと目的分子の間の特異的な親和性に基づき、分離を行う方法です。リガンドと目的分子は結合させたのち、しばしば適当な条件下にて溶出することが可能です。例えば、バッファー、塩濃度、pHを変えることでリガンドからの目的分子の溶出を行うことができます。

 

ポールのアフィニティークロマトグラフィー用製品は、ボトル入りの担体があります。弊社は目的とするアプリケーションによって、以下の基礎担体を取り揃えています。

 

  • ブルートリスアクリル Mアフィニティークロマトグラフィー担体はリン酸化酵素、アルブミン、インターフェロンおよび凝固要素など、幅広い酵素やタンパク質の精製に使用可能なアフィニティークロマトグラフィー用担体です。

 

  • ヘパリンハイパーD Mアフィニティークロマトグラフィー担体は、凝固因子、成長因子、リポタンパク質といったヘパリン結合性生体分子の精製に向けた、高容量のアフィニティー精製用担体です。

 

  • リジンハイパーD アフィニティークロマトグラフィー担体はヒトや動物の血漿から、プラスミノーゲンなどのリジン結合性生体分子を精製するための高容量なアフィニティー精製用担体です。

 

 

イオン交換クロマトグラフィーは、物質をその正味の表面荷電に基づいて分離します。分子は陰イオン(負の電荷を持つ)、陽イオン(正の電荷を持つ)のどちらかに分類されますが、タンパク質類などの分子によっては陰イオン・陽イオンの両方を持つものがあります。正電荷の担体(陰イオン交換体)は「全体として負電荷の成分」を結合し、反対に負電荷の担体(陽イオン交換体)は「全体として正電荷な成分」を結合します。

イオン交換体は結合力の強弱によりさらに細かく分類することができます。強イオン交換体は広範囲のpHでチャージ(イオン化)され、弱イオン交換体は限られたpH範囲でしかイオン化しません。

 

以下に、もっとも代表的な4 種のイオン交換体を示します。

 

  • 4級アンモニウム(Quaternary ammonium; Q)基をもつ強陰イオン交換体
  • ジエチルアミノエチル(Diethylaminoethyl; DEAE)基をもつ弱陰イオン交換体
  • スルホン酸(sulfonic acid;S)基をもつ強陽イオン交換体
  • カルボキシメチル(Carboxymethyl; CM)をもつ弱陽イオン交換体

 

バッファーの選択

 

一般的にイオン交換クロマトグラフィーでは、イオン強度の低いバッファーをロードします。この条件下では、電荷を帯びた高分子は反対の電荷をもつ固相に捕捉され、固相と同じ電荷をもつ高分子は吸着せずに通過します。イオン強度の低いバッファーをさらに加えて交換体を洗浄すると、残存していた非吸着な成分が完全に洗い流されます。

その後、塩濃度を上げたバッファーを加えることで、イオン交換体に吸着した成分を溶出します。移動相のイオン強度を上げると、塩イオンがイオン交換体上の帯電物質に吸着しようとして競合し、先に吸着していた高分子を引き離すため、その高分子をマトリックスから溶出することができます。陽イオン交換には陰イオンのバッファー(負電荷を持つ)を、陰イオン交換には陽イオンのバッファー(正電荷を持つ)をご使用ください。

 

pHの選択

 

pHは、強イオン交換体の電荷に影響を及ぼすことはありませんが、溶液中の高分子の電荷には影響を与えます。イオン交換クロマトグラフィーの処理pHは、バックグラウンドとなる混在物質に対して、目的分子の分解能が最大となるよう選定します。例えば、目的分子の結合量を最大にし、混在物質の結合量を最小限に抑えるpHを選定した場合(ポジティブモード)、目的分子の溶出は塩濃度を上げることで達成されます。逆に、混在物質の結合量を最大化し、目的分子の吸着量を最小限〜ゼロにするpHを選定した場合(ネガティブモード)、目的とする分子は全て通過し、混在物質がマトリックスに吸着することで分離が行われます。

イオン交換体や操作pHを慎重に選定すると、1ステップで最大の回収量と純度とを得ることができます。ただし、1つのステップで100%の純度を実現することは不可能なので、目的分子とバックグラウンドとなる混在物質の化学特性の相違を利用しながら、複数のステップを組み合わせることが必要です。

 

溶出塩の選択

 

吸着ステップの後に用いる溶出用バッファーは、塩濃度をよく選定して、目的とする分子と同時にイオン交換体に吸着している混在物質が一緒に溶出してこないよう注意します。溶出塩のイオンは、グラジエントもしくはステップで0 〜 1.0M の範囲にあり、担体上の荷電基から他の分子を置換できるものを使用します。一般的に、使用される陽イオンの置換効果はCa2+ > Mg2+ > Na+ > K+ > NH4+の順となっており、使用される陰イオンの置換効果はPO43- > SO42- > COO- > Cl-の順となっています(この順序はホフマイスター系列を元にしています)。

しかしながら、もっとも強力な溶出塩が常に最適とは限りません。理想的には複数の塩をテストして、試行錯誤を伴いながら最適な溶出条件を見つけるべきです。一般的に使用しやすい、NaClやKClから条件検討を始められるでしょうが、CaCl2やMgCl2も考慮するべきです。また溶出塩の選定の際には、目的分子の純度、安定性、活性に対する影響も考慮する必要があります。

 

ポールのイオン交換クロマトグラフィー用製品は、ボトル担体、充填済みカラム、およびメンブレンがあります。クロマトグラフィーにおいて、一般的には主にレンジベースの手法が用いられています。一方で、レンジベースの処理に限界がある場合(例えばウイルスや大きな分子の精製など)には、メンブレンが頑丈かつスケーラブルで、経済的な方法となることが知られています。メンブレンはレンジよりも高い流速を持ち、レンジでは限界があるアプリケーションでよく機能します。

 

イオン交換クロマトグラフィーにおけるムスタング メンブレンの使用

 

大きな分子の精製が必要な場合や、より速い流速が必要なクロマトグラフィーでは、メンブレンの使用が推奨されます。メンブレンクロマトグラフィーは、従来のレジンを用いたクロマトグラフィーに比べて著しく速い流速での処理が可能です。これにより処理時間を短縮し、スループットが増加できるため、処理が極めて経済的となります。

 

ポールのムスタング メンブレンは対流性の高い孔構造と、高い流速でも比較的左右されない動的結合容量を持っており、プラスミドやウイルスのような大きな分子にも適しています。ポールのイオン交換クロマトグラフィー用メンブレンデバイスは、お客様に以下の利点をご提供しています。

 

  • スケーラビリティー:研究室規模のサンプル処理では、単一サンプル向けのアクロディスク ユニットや多数のサンプル処理向けのアクロプレップ アドバンスフィルタープレートでムスタング メンブレンの使用が可能です。

 

  • アプリケーションに特化したメンブレンの化学的性質:ムスタング Qメンブレンは強陰イオン交換体で、プラスミドDNA、負電荷のタンパク質、ウイルス性粒子と効果的に結合します。ムスタング Sメンブレンは強陽イオン交換担体で、正電荷のタンパク質やウイルス性粒子と効果的に結合します。

 

  • 結合容量と流速:ムスタング メンブレンは、高い流速でも回収率への影響が少なく、より迅速な精製が行えます。

 

ゲル・イン・ア・シェル技術:拡散効果の強化

 

従来の微細孔イオン交換体は、古典的な形式の孔による拡散を用いております。従来形式の孔を用いた拡散では、流速を上げるに伴い結合能力が急速に低下するという難点があります。これに対し、ポールのセラミックハイパーD Fイオン交換クロマトグラフィー担体は、強化された拡散機構をもち、より急速かつ大量移送のメカニズムをご提供します。目的分子は単に穴の表面だけではなく、ゲルで満たされた孔のいたるところに結合するので、担体全体の結合能力が高まります。 

 

イオン交換クロマトグラフィー担体のハイパーD シリーズは、高い動的結合容量(動的結合力)を持ちます(担体1 mLあたり50-110 mg BSA/mL)。

担体の動的結合容量は、適切な結合バッファーで調製した5 mg/mL BSA(陰イオン)もしくはリゾチーム(陽イオン)溶液を、1 mL充填カラムにポンプを用い、その結合容量を超えるまで加えて測定しました。この「ブレークスルー」に到るタンパク質量を計算し、結合容量をmg/mL で示します。より良い分解能を得るために、粒子サイズ 50 μm(ハイパーD F)の陰イオン交換体および陽イオン交換体をご用意しております。

 

 

疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC:Hydrophobic Interaction Chromatography)

 

HICは、イオン化誘導かつデュアルモードリガンドで、pHに依存した挙動を利用したクロマトグラフィーです。吸着は穏やかな疎水性相互作用に基づき、カオトロピック塩や他の塩溶液を加えることなく吸着を行うことができます。溶出は電荷の反発作用に基づき、溶液のpH を減少させることで行います。

 

MEP ハイパーセル ミックスモードクロマトグラフィー担体は、モノクローナルおよびポリクローナル抗体の捕捉・精製用に設計された、高容量で選択性の高い担体です。

この担体は抗体選択性リガンドである4-メルカプト-エチル-ピリジン(4-MEP)を備えています。リガンドと目的分子の吸着は穏やかな疎水性相互作用に基づき、カオトロピック塩や他の塩を加えることなく行うことができます。目的分子の溶出は電荷の反発作用に基づき、溶液のpH を減少させることで行えます。

 

HEA および PPA ハイパーセル ミックスモードクロマトグラフィー担体は、「ミックスモード」メカニズムを利用し、タンパク質とリガンドの「静電性および疎水性の組み合わせ」に基づきクロマトグラフィーを行えます。HEA および PPA ハイパーセルは、従来のイオン交換やHICでは得にくいユニークで様々な選択性を提供します。例えばミックスモードの相互作用を利用することで、同等〜非常に近い等電点を持ち、イオン交換のような方法では分離できないタンパク質の選別を行うことができます。

 

 

ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー

 

ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーは「疑似親和性」クロマトグラフィー、もしくは「ミックスモード」クロマトグラフィーと考えられます。さまざまなプロセスにおいて効果的な精製法で、従来よりのイオン交換や疎水性相互作用による分離を補う生体分子の選択性をご提供します。HA ウルトロゲル ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー担体は、ハイドロキシアパタイト/ アガロースの複合体であり、ハイドロキシアパタイトの微細結晶を包括固定した球状アガロースビーズによる、3次元架橋構造をもちます。本担体は研究・開発スケールから工業生産まで、生体分子の分離にお使いいただくことができます。

 

 

界面活性剤除去用クロマトグラフィー担体

 

血漿由来のサンプルはウイルスを含む可能性があります。ウイルスはナノろ過(非油膜性ウイルスのサイズ排除)、および非イオン溶剤と界面活性剤による処理(非脂質性エンベロープを持つウイルスに効果がある)を組み合わせることで効果的に除去・不活性化されます。

ウイルスの除去後、生体分画から溶剤や界面活性剤を除く必要が生じます。界面活性剤の除去は、吸着剤による分離、サイズ排除、親和性、もしくは植物油とC18 の逆相クロマトグラフィーを併用したバッチ抽出などさまざまな手法により行うことができます。

 

SDR ハイパーD 界面活性剤除去用クロマトグラフィー担体は、生物由来の液体から溶剤や界面活性剤を除去できるよう設計されたユニークな担体です。本担体は、3次元架橋の疎水性ポリマーで孔を満たしたシリカビーズで構成されています。粒子サイズの分布(40-100 μm)、シリカビーズのもつ小孔、および官能基の疎水性により、生物由来の液体から特異的に溶剤や界面活性剤を除去することができます。
 

Lab-App-DNA-RNA-Purification-genomicdnapurification

技術資料