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HPLCカラムの寿命を延長するために: シリンジフィルターを用いたろ過の有効性

研究背景

アクロディスク PSFシリンジフィルターはHPLCカラムの寿命を大幅に延長します。

微粒子を含んだ試料を注入すると、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)カラムがやがて目詰まりを起こし、そのカラムが接続されたインジェクターの寿命も縮まり、送液ポンプのメンテナンス作業が増大する結果となります。カラムに微粒子が蓄積すると、カラムの背圧が増し、バンド形状が歪み、プレートの理論段数が小さくなり、結果的にカラムが劣化し、そのHPLC分析結果に様々なノイズが混入し、分析結果解釈するのが困難になります。

 

HPLCアプリケーションにおいて、通常、微粒子除去用に選定されるのは、孔径0.45μmのシリンジフィルターです。ポールでは、試料のろ過を行わない場合とポールのアクロディスク PSFシリンジフィルターでろ過した場合、また他社製品でろ過した場合のHPLCカラムの寿命(カラムが目詰まりを引き起こすまで)を比較した研究結果をまとめました。

 

その結果、カラムの寿命は、試料中の微粒子量に依存し、実際にどれくらいカラムの寿命が延長されるかは、場合により異なることがわかりました。アクロディスク PSFシリンジフィルターによりろ過された試料をHPLCカラムに972回の注入後も実質的にカラムの背圧が増加することなく、HPLCカラム寿命を大幅に延長しました。

HPLCカラムの劣化の背景

HPLCのカラムの劣化には主に4つの原因(目詰まり、亀裂、サンプルの吸着、薬品による腐食)がありますが、その中でもっとも頻繁に見られるのが目詰まりです。微粒子を含んだ試料を注入していくと、やがてHPLCのカラムの目詰まりが起こり、カラムの背圧が増し、カラムの寿命が短くなりますが、試料をろ過しておくと、送液ポンプ部品や注入機、検出装置の運転で発生するトラブルが少なくなります。HPLCアプリケーションにおいて、通常、微粒子除去用に選定されるのは、孔径0.45μmのフィルターですが、HPLCカラム劣化を防ぐ最適なフィルターを選出しないと、カラムの交換が頻繁になり、結果HPLCを用いたワークフローに掛かるコストやメンテナンス時間が増大してしまいます。

 

HPLC分析のために、試料の前処理としてろ過を行うことは重量視されています。試料をカラムにインジェクションする前に、ろ過するとHPLCカラムの寿命が延長されるが一般的に認められたはいますが、カラム寿命の延長を十分に定量化したデータはあまり知られておりません。この研究の目的は、HPLCのサンプル調製用のシリンジフィルターを選択する際に、フィルターの効率を考慮することが重要であり、ろ過によってカラムの寿命が長くなるということを実証することです。

 

この研究では、0.45μmの平均直径のラテックス粒子を用いて、HPLCの試料をろ過する目的で使用される、孔径0.45μmのポールと他社の3つのシリンジフィルターの粒子の膜保持効率を調べました。この研究においては、ろ過による試料の調製とシリンジフィルターのラテックス粒子の膜保持効率の測定において十分な再現性が示されました。

 

各シリンジフィルターのラテックス粒子の膜保持率を、実際のHPLCのカラムへの適用と相関させるために、試料のろ過を行わない場合とアクロディスク PSFシリンジフィルター、または他社製品でろ過した場合のHPLCカラムの寿命(カラムが目詰まりを引き起こすまで)を定量化して比較、検討を行いました。

試験方法

試験材料

  • Latex spheres and surfactant were purchased from Sigma. 0.45 µm average diameter latex spheres:
  • L/N 31K1123, Cat #: LB-5, Triton X-100 L/N: 121K0090, Cat #: X-100
  • 25 mm syringe filters with 0.45 µm pore size ratings were obtained from Pall, Company A, and Company B
  • Pall Acrodisc PSF syringe filters with GHP membrane: P/N AP-4557, L/N: A224102521, A224227411, and A22422044
  • Company A syringe filters with PVDF membrane: L/N: F2EN42569, F0BN28908, and F2NN83751
  • Company B syringe filters with PVDF membrane: L/N: 11067, 11146, and 99297

計装

  • High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
  • Waters (Milford, MA, USA) 616 Pump
  • Waters 600s Controller
  • Waters 717plus Autosampler
  • Ultraviolet/Visible Spectrophotometer (UV/VIS), HP 8452A Diode Array

カラムの仕様

  • Luna 5 µm C18(2), columns were purchased from Phenomenex (Torrance, CA, USA): Size: 30 x 3.0 mm, P/N: 00A-4252-Y0, S/N: 160111-3, 159485-4, 159742-3, and 159485-3

 

試験方法

The UV/VIS Spectrophotometer was used for measuring absorbance of latex-sphere solutions. The maximum absorbance of the latex-sphere solution was observed at 272 nm, which was used to correlate latex sphere concentrations with absorbance. The surfactant solution, 0.1% Triton X-100 that is free of latex spheres, was measured as the blank at 272 nm. A series of standard solutions of 0.0025%, 0.0050%, 0.0075%, and 0.01% 0.45 µm latex sphere concentrations were made and used for creating the calibration curve. The linear relationship between latex sphere concentrations and absorbance was established, which is in accordance with Beer’s law. A correlation coefficient of 0.9999 was obtained. The 0.01% 0.45 µm average diameter latex spheres solution was used for the retention efficiency study. The challenge solution was passed through each individual syringe filter and a 3 mL eluted aliquot was collected and analyzed at 272 nm. Three different filters from each of the three lots were tested (i.e., nine filters from each manufacturer were individually analyzed).

The HPLC was utilized for the column-plugging study. Column life was evaluated by comparing initial backpressure to backpressure after injections. A new LUNA* C18(2) 00A-4252-Y0 column (S/N: 160111-3) was installed. The outlet of the column was disconnected from the detector and allowed to run to drain. This modification allowed quicker injections for a more efficient determination of column backpressure. Acetonitrile:Water (35:65, percentage by volume) was used as mobile phase, with a flow rate of 1 mL/min. Column temperature was controlled at 25 °C. The system was set to automatically inject 50 µL each time. The column-plugging solution consisted of 0.05% (by weight) 0.45 µm average diameter latex spheres in 0.002% Triton X-100 solution. The first step was to inject this solution without any filtration to see how long the column would last without filtration. After the column was plugged (i.e., column backpressure reached 3500 psig, 241.3 bar, 507.6 kPa), a new LUNA C18(2) 00A-4252-Y0 column (S/N: 159485-4) was installed. This time the same latex-sphere solution was subjected to filtration using Company A filters. Thirty samples were generated with 30 Company A filters (ten from each of the three lots). The injections were carried out from sample vial one through vial 30 and then repeated in this sequence. The column backpressure was recorded with the number of injections. This procedure was repeated with new columns, S/N 159742-3 and 159485-3, for studies with Company B and Pall filters, respectively.

試験結果と考察

フィルターのラテックス粒子の除去性能

Tables 1 から3はポール、他社A、他社Bのシリンジフィルターのラテックス粒子に対する除去率を示します。

 

ポールのGHPメンブレンのアクロディスク PSFシリンジフィルターの平均孔径0.45μmのラテックス粒子に対する除去率は平均94.9%で、他社製のシリンジフィルターでは、平均90.5%、33.0%でした。ポールのシリンジフィルターのほうがロット間格差も優れており、相対標準偏差(RSD)は3.5%でした。

HPLCカラムの寿命を延ばすためのろ過の役割

HPLCカラムの寿命に及ぼすフィルターの影響

Figure 1は、カラムの背圧と注入回数の関係を示しています。ろ過を行わない場合、21回の注入後カラムの目詰まりが発生しています。0.05%のラテックス溶液を他社製フィルターでろ過した場合、それぞれ37回目、487回目の注入でカラムに目詰まりが発生しました。また他社製フィルターのろ液はどちらも透明度が低く、相当数のラテックス粒子がろ液中に存在していることがわかりました。

 

0.05%のラテックス溶液をGHPメンブレンのアクロディスク PSFシリンジフィルターでろ過し、HPLCシステムに注入した場合、972回目の注入後もカラムの背圧は上がらず、またろ液が透明であることから、ラテックス粒子がきちんと除去されたことがわかりました。

結論

HPLC用の試料を事前にろ過することは、重要であることが示されました。

3社の0.45μm孔径のシリンジフィルターのうち、ラテックス粒子の平均除去率がもっとも高く(94.9%)、ロット間格差も小さいのはポールのGHP膜のアクロディスクPSFシリンジフィルターでした。HPLCシステムへの注入前のサンプルろ過が必須であることも実証されています。データからは、同じ除去定格を持つ各社メーカーの同等レベルのシリンジフィルターでも、その除去性能が異なることがわかります。

 

ポールのGHP膜のアクロディスク PSFシリンジフィルターは、HPLCカラムの背圧を大きく増すことなく、そのカラム寿命を46倍延長することができました。

References

  1. L.R. Snyder, J.J Kirkland, and J.L. Glajch, Practical HPLC Method Development, 2nd Edition, John Wiley & Sons, Inc., 1997.
  2. J.A. Dean, Analytical Chemistry Handbook, McGraw-Hill, Inc., 1995.
  3. M.L. Mayer, LC.GC, 14 (10), 902 (1996).
  4. M.L. Mayer, American Laboratory, 29 (1), 1 (1997).
  5. J. Merrill, American Laboratory, 19 (10), 74 (1987).